主要仪器试剂

仪器：微型电泳系统、电源、注射器、固定和染色用容器

试剂：丙稀酰胺、双－丙稀酰胺、载体两性电解质、尿素、过硫酸胺、TEMED、TritonX－100、2－巯基乙醇、溴酚蓝、磷酸、氢氧化钠、氯化钾、三氯乙酸、考马斯亮蓝、甲醇、乙酸。

储存液：1）30%（w/v）丙稀酰胺，1%（w/v）双－丙稀酰胺；2）20%Triton X100；3）10%三氯乙酸；4）1%三氯乙酸；5）1%溴酚蓝；6）考马斯亮蓝染色液；7）考马斯亮蓝脱色液；

灌胶

以灌制8cm×7cm×0.75mm pH4-6变性等电聚焦凝胶的配方。其他pH范围等电聚焦可以参考表格来配置。

水：5.4ml； 储存液1）：2.0 ml； 载体两性电解质溶液pH3.5-10 48μl； 载体两性电解质溶液pH4-6 240μl； 超纯尿素 6.0 g ；10%过硫酸胺25μl； TEMED：20μl

灌胶步骤：

1.组装灌胶器；

2.将尿素、水、溶液和载体两性电解质溶液混匀，避免剧烈摇动，轻微加热尿素溶解更快（带手套，丙稀酰胺有毒）；

3.加入过硫酸胺和TEMED，轻轻混匀（开始聚合，操作要迅速）；

4.将上述混匀溶液倒如灌胶器（尽量避免气泡产生）；

5.插入梳子，将梳子侵入胶内（不要产生气泡）；

6.聚合约1小时；

7.聚合完成，小心拔去梳子；

8.将凝胶同冷却装置连接后插入电泳池，蛋白样品上样前最好用阳极电极液注入上槽中确定是否有渗漏。

注意：

1.上样前冲去上样空底部未聚合的丙稀酰胺，否则电泳过程中会发生聚合；

2.现在有商品化的等电聚焦凝胶，但只限于水平平板电泳系统（如Pharmmacia－LKB,Hoefer）.

样品制备和上样

一般不同厚度的凝胶，不同的梳孔数目会有不同的上样量，例如：0.75mm厚、15孔的凝胶每孔最大上样量大约15μl。

变性凝胶上样缓冲液2×Buffer（适用于pH4-6）：1）尿素：2.4g；2）pH3.5-10载体两性电解质：20μl；3）pH4-6载体两性电解质：100μl；4）20%Triton X－100：500μl：5）2－巯基乙醇：50μl；双蒸水：1.7ml；1%溴酚蓝：200μl

电泳：

操作步骤：

1.将蛋白样品于等体积的2×上样缓冲液混合，10000×g离心5min以除去蛋白质沉淀；

2.用微量注射器将蛋白质样品加入到上样空底部，注意不要溢出来。注意：对于考马斯亮蓝染色液来说，每个泳道10-30μg的蛋白混合粗提物（我们俗称粗抗原）或者5-10μg单一蛋白组分是较合理的上样浓度。

电泳液：

1.上槽中加入阴极电泳液（20mM氢氧化钠：须由1M储存液新鲜配置）；

2.下槽中加入阳极电泳液（10mM磷酸：须由1M储存液新鲜配置）。

等电聚焦电泳条件：

1.接好电极；

2.恒压150V电泳30min；

3.恒压200V电泳2.5h，开始时候控制电流为10mA左右，在聚焦过程中电流有所下降，电泳内室温度在电泳的过程中将升至40－50摄氏度。

电泳聚焦后处理：

测定pH梯度：

1.将凝胶条切成0.5cm或1cm的小片；

2.将每小片凝胶在1ml 10mM KCl中 浸泡30min；

3.测读此KCl溶液的pH值、

凝胶的固定：

1.将凝胶于10%三氯乙酸中浸泡10min；

2.换成1%三氯乙酸溶液继续浸泡至少2h以上，以去除载体两性电解质，浸泡过夜可以更好的降低考马斯亮蓝对载体两性电解质的染色。

凝胶的染色：用考马斯亮蓝染色，然后脱色，制成干胶。
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DYCP-37B 等电聚焦多用途电泳槽
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等电点标准蛋白（pH3－pH10）试剂盒

所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（α-amino）。這些可游离的基团随着pH变化可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）及负电荷（anion）等三种，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。
关键词：电泳酰胺聚丙烯聚丙烯酰胺等电聚焦电泳蛋白质等电点等电聚焦电泳isoelectricfocusingIEF
实验原理

所有的氨基酸均为两性物质，即它们至少含有一個羧基（carboxyl）及一個氨基（α-amino）。這些可游离的基团随着pH变化可以三种形式存在，即正电荷（cation）、两性离子（zwitterion）及负电荷（anion）等三种，在酸性溶液中带正电荷，在碱性溶液中带负电荷。若氨基酸在某一pH值下其净电荷为0，且在电场中不移动时，称此pH值为它的pI值（等电点）。因为净电荷为零，净电斥力不存在的緣故，大部份蛋白质在等电点的pH值下，其溶解度最小。相反的，当溶液的pH值低于或高于pI，所有蛋白质分子所带净电荷为同号，彼此之间有相斥力，不会聚集。所以，將pH调到等电点的大小，则大部份的蛋白质將会沉淀，这种现象可以应用于估算某蛋白质的等电点；另一方面，也可以应用在电泳，达到分离蛋白质混合物的目的，这种方法称为等电聚焦电泳（isoelectric focusing），简称为IEF(见图4.8)。

图4.8 等电聚焦电泳示意图

上图左以A，B两种蛋白质为例，作出它们的净电荷曲线图，横轴代表环境中的pH值，纵轴代表蛋白質的净电荷，在 pH 6.5时，A带有两个正电荷，B带有一个负电荷。使A与B的净电荷为0的pH值分別为pH9和pH5，这就是它们的「等电点」。

 IEF是在具有pH梯度环境中进行的电泳。将蛋白质置于不同pH梯度的胶体进行电泳，它会朝着与自身所带电荷相反的电极方向移动，直到抵达等电点（pI）相同的pH值处才停止，如果它移到別的pH处，会因为带电而再度移动到和它pI相符的pH处。

IEF-PAGE操作简单，只要一般电泳设备就可进行，电泳时间短、分別率高、应用范围广，可用于分离蛋白质及测定pI，也可用于临床鉴别诊断、农业、食品研究等各种领域。

试剂和器材

一、试剂

Acr－Bis贮存液：29.1g Acr,0.9g Bis, 用无离子水溶解后定容至100ml,不溶物过滤去除后置棕色瓶贮于冰箱。

等电点标准蛋白（pH3－pH10）试剂盒，临用前稀释至0.1－0.3mg/mL。

适合于pH3－pH10范围的电极溶液：

A: 阴极电极溶液（1mol/L NaOH）:称NaOH(AR)4g，加去离子水使其溶解，冷却至室温再定容至100ml；

B: 阳极电极溶液（1mol/L H3PO4）:取H3PO4（85％）6.7ml，加去离子水定容至100ml。

固定液：称取磺基水杨酸3.5g，三氯乙酸10ml，甲醇35ml，加去离子水至100ml。

染色液：称取考马斯亮蓝R250 0.1g，冰乙酸10ml，甲醇35ml，加去离子水使其完全溶解，在定容至100ml，过滤后置棕色瓶保存。

脱色液：取无水乙醇50ml，冰乙酸20ml，加蒸馏水至200ml。

保存液：取无水乙醇25ml，冰乙酸10ml, 甘油5ml，加蒸馏水至100ml。

10％过硫酸铵，TEMED, 40%两性电解质载体（pH3－pH10）。

二、材料

待测已纯化的蛋白质样品（脱盐），浓度0.5mg/mL。

三、器材

等电聚焦电泳槽, 移液管（1，5，10ml），烧杯（25，50，100ml），细长头的吸管，微量注射器（10μL或者50μL），漏斗，滤纸，镊子。

操作方法

一、准备工作

配制凝胶前，应把玻璃板准备好。即将两块干净的玻璃板叠放在一起，之间夹上所需凝胶厚度的胶条进行密封。然后用文具夹将玻璃板四周固定好。注意夹子作用力点在胶条正中，以防漏胶。

二、配制凝胶

取Acr-Bis储备液2.0ml；两性电解质0.5ml；去离子水5.5ml；TEMED 8μl置于小烧杯中混匀，再加入10% 过硫酸胺50μl，用磁力搅拌器充分混匀2min。然后用注射器吸净混合液，排除气泡，缓缓注入玻璃板的夹隙内。注意勿出现气泡。

三、电泳

1. 剥胶板 将胶板取出，揭去上层的玻璃板和胶条，然后用蒸馏水轻轻冲洗一下胶面。

2. 点样 用小纸条（0.5 cm′0.5cm）蘸样，均匀地点在胶板上，点样要求整齐、迅速。注意胶板两边要留出一定空间。通常把PI在酸性范围的样品放在偏碱性的位置（负极），PI偏酸性的样品放在偏酸性的位置（正极），标准蛋白质混合样品放在中间。

3. 进样 将浸入电极液的滤纸条取出，使其分别平直紧贴在胶面两端，然后放入电泳槽内，注意正负极相吻合。将电极板正极（电极条浸有H3PO4的一侧）与负极（电极条浸有NaOH的一侧）分别与电泳仪的正、负极连接。接通冷却水，在室温下电泳，把电泳仪调至电压50V，电流以每板胶不超过17mA为准，然后开始电泳。进样时间一般在1.5－2小时。

4. 揭样纸 待电流降至每板胶3mA以下时，切断电源，取出胶板，揭去加样纸后，将电压调至220~320V继续电泳。5. 加压 当电流降至每板胶3mA以下时，升高电压至580V，继续电泳1.5小时左右。

6. 电流降至每板3mA以下时，切断电源，停止电泳。

四、固定、，染色和脱色

将凝胶板放在培养皿中，加入固定液，浸泡数小时后，用脱色液清洗两次，每次10min, 然后加入染色液，室温下放置15－30min，再用脱色液洗脱数次，直至谱带清晰，放入保存液中浸泡10min,可制干板。

五、制作干胶板

1. 取完全浸湿的平整玻璃纸一张，于玻璃板上铺平，纸与板之间不可有气泡。

2. 将凝胶铺于上述玻璃纸上，对齐中心位置，使四边留出距离相等，随后将胶与纸之间的气泡轻轻赶跑。然后，把另一张玻璃纸折起盖在胶面上，并与下层玻璃纸对齐，胶与两层玻璃纸之间要绝对避免气泡，要求光滑平整。

3. 将凝胶四边上下两层玻璃纸贴紧，使胶边边缘上完全没有气泡。然后将各边的玻璃纸多余部分折向玻璃板反面。

4. 置于室温中自然干燥，完全干燥后的胶板，手感如触及玻璃板。这时，可将胶板揭下，裁去边角多余的纸，即可得一张图谱清晰的干胶板。

注意事项

（1）支持介质

 在IEF-PAGE中，丙烯酰胺純度极为重要，Acr及Bis中如有丙烯酸，则引起聚焦后pH剃度漂移，一般需用重结晶法进一步纯化Acr及Bis。 最近Pharmacia公司推出Amberlite MB-6除去丙烯酸，其效果较再結晶法更佳。

（2）两性电解质载体

 两性电解质载体是IEF-PAGE中最关键的试剂，直接影响pH梯度的形成，以及蛋白質

的聚焦。因此，要选用优质的两性电解质载体，在凝胶中，其终浓度一般为1-2%。pH梯度的线性依赖于两性电解质的性质，选择哪种pH梯度范围的两性电解质载体，則与被分离蛋白质的pI有关。

（3）样品预处理与加样方法

 实验证实，盐离子可干扰pH梯度形成，并使区带扭曲。为了防止上述影响，进行IEF-PAGE时，样品应透析或用Sephadex G-25脱盐，也可将样品溶解在水，或是低盐缓冲液中，使其充分溶解，以免不溶小顆粒引起拖尾。但某些蛋白质在等电点附近，或水溶液及低盐溶液中，溶解度较低，則可在样品中加入两性电解质，如加入1%甘氨酸或对1%甘氨酸透析，虽然甘氨酸是两性电解质，但不影响pH梯度的形成，可利用其在溶液中的偶极距作用增加蛋白質的溶解性。此外，还可在样品及凝胶溶液中加入无离子去污剂如Tween 80, Triton X-100, Nonide P-40等或加入相同浓度的尿素(4 M)，以免氰酸盐引起蛋白质的胺甲酰化，含有尿素的样品及凝胶板只能当天使用。

 加样量取决于样品中蛋白质的种类、数目及检测方法的灵敏度。如用银染色，加样量可减少到1 μg。一般样品浓度以0.5-3 mg/ml为宜，最适加样体积为10-30 μl。如样品很浓，可直接在凝胶表面加2-5 μl；如样品很稀，可加样300μl。值得注意的是：对不稳定的样品可先将凝胶进行15-30 min预电泳使pH梯度形成，然后将样品放再靠近pI的位置以缩短电泳的时间，但不要将样品正好加在pI处和紧靠阳、阴极的胶面上，以免引起蛋白质变性造成区带扭曲。一般加样电泳半小时后，取出加样滤纸以免引起拖尾現象。

 （4）电功率、时间等因素

在IEF电泳中，随着样品的迁移越接近pI时，电流则越来越小。为使各成分能更好

地分离，要保持一定的电功率，就应不断增加电压，电压增高可缩短pH梯度形成，和蛋白质分离所需的时间，但过高的电压会使凝胶板局部范围过热，因此，在电泳过程中，应通冷却水，水温以4-10℃为宜，流量5-10 l/min。一般宽pH范围电泳时间以1.5-2 h为宜。

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聚丙烯酰胺凝胶平板等电聚焦电泳测定蛋白质等电点（图）