PCR的要素

　　基本的PCR须具备

 

　　1.要被复制的DNA模板 Template

  

 

        2.界定复制范围两端的引物Primers.

 

　　3.DNA聚合酶Taq. Polymearse

 

　　4.合成的原料（四种脱氧核苷酸）及水。

PCR的反应包括三个主要步骤

　　分别是1. Denaturation 2. Annealing of primers,3. Extension of primers。 所谓 Denaturing乃是将DNA加热（至90~95℃）变性， 将双股的DNA加热后转为单股DNA以做为复制的模板. 而Annealing 则是令 Primers于一定的温度下（冷却至55~60℃）附着于模板DNA两端。 最后在DNA聚合酶e.g. Taq-polymerase 的作用下（加热至70~75℃）进行引物的延长 Extension of primers及另一股的合成。

　　PCR的最早设想 核酸研究已有100多年的历史，本世纪60年代末、70年代初人们致力于研究基因的体外分离技术，Korana于1971年最早提出核酸体外扩增的设想：“经过DNA变性，与合适的引物杂交，用DNA聚合酶延伸引物，并不断重复该过程便可克隆tRNA基因”。

PCR的实现

　　1985年美国PE-Cetus公司人类遗传研究室的Mullis 等发明了具有划时代意义的聚合酶链反应。其原理类似于DNA的体内复制，只是

PCR的改进与完善

　　Mullis最初使用的DNA聚合酶是大肠杆菌 DNA 聚合酶 I 的Klenow片

　　段，其缺点是：

　　①Klenow酶不耐高温， 90℃会变性失活，每次循环都要重新加。

　　②引物链延伸反应在37℃下进行，容易发生模板和引物之间的碱基错配，其PCR产物特异性较差，合成的

　　DNA片段不均一。此种以Klenow酶催化的PCR技术虽较传统的基因扩增具备许多突出的优点，

　　但由于Klenow酶不耐热，在DNA模板进行热变性时，会导致此酶钝化，每加入一次酶只能完成

　　一个扩增反应周期，给PCR技术操作程序添了不少困难。这使得PCR技术在一段时间内没能引

　　起生物医学界的足够重视。

　　1988年初，Keohanog改用T4 DNA聚合酶进行PCR，其扩增的DNA片段很均一，真实性也较

　　高，只有所期望的一种DNA片段。但每循环一次，仍需加入新酶。

　　1988年Saiki 等从温泉中分离的一株水生嗜热杆菌thermus aquaticus 中提取到一种

　　耐热DNA聚合酶。 此酶具有以下特点：①耐高温，在70℃下反应2h后其残留活性大于原来的

　　90%，在93℃下反应2h后其残留活性是原来的60%，在95℃下反应2h后其残留活性是原来的40

　　%。②在热变性时不会被钝化，不必在每次扩增反应后再加新酶。③大大提高了扩增片段特异

　　性和扩增效率，增加了扩增长度2.0Kb。由于提高了扩增的特异性和效率，因而其灵敏性也

　　大大提高。为与大肠杆菌多聚酶I Klenow片段区别，将此酶命名为Taq DNA多聚酶Taq DNA

　　Polymerase。此酶的发现使PCR广泛的被应用。